WNT5A与小细胞肺癌临床特征的相关性研究及其对细胞迁移作用的影响

WNT5A与小细胞肺癌临床特征的相关性研究及其对细胞迁移作用的影响 [标签:url] [标签:科室] 摘要：SCLC高度恶性，极易早期转移，其中局限期患者约占40%，中位生存期18～23个月，广泛期约占60%，中位生存期7～12个月。大部分患者在2年内出现 转移，因此探索SCLC转移的机制，鉴定SCLC转移的预测因子以及针对性的靶向治疗对提高SCLC的治 果具有重要意义。 肺癌是我国死亡率最高的恶性 ，其中小细胞肺癌（smallcelllungcaner，SCLC）为其中的一种，约占15%左右。SCLC侵袭性高、易复发，容易发生早期广泛转移。多数患者在初次就诊时已处于疾病的广泛期，仅约30%的患者处于局限期。虽然对放化疗相对敏感，但SCLC的治愈率不高，中位生存期仅12～18个月，5年生存率<10%。虽然目前的治疗手段可以为SCLC的治疗提供一定帮助，但关于SCLC高转移的机制仍然是困扰临床工作和影响SCLC治疗的一大难题。 WNT5A是近年来发现的一种细胞自分泌型蛋白，WNT5A定位于3p14～p21区域。最近研究表明WNT5A的过度表达与恶性 的迁移、侵袭有着密切联系。其表达在不同的 具有差异性。本研究对WNT5A在SCLC及正常肺组织中的表达量进行检测，分析WNT5A的表达与SCLC不同临床病理特征的相关性，并对WNT5A促进SCLC细胞系DMS153迁移及其作用机制进行研究，为后续探索WNT5A是否可以成为预测SCLC转移的分子标志物以及治疗新的靶点提供了理论基础。 材料与方法 1.研究对象 选取天津医科大学 医院2010年8月至2015年7月临床资料完整的SCLC石蜡标本作为研究对象共79例。其中男性55例，女性24例。年龄41～82岁，平均年龄60.3岁。 TNM分期Ⅰ期24例、Ⅱ期18例、Ⅲ期16例、Ⅳ期21例。所有病例通过手术、气管镜、穿刺获得病理标本并确诊为单纯性SCLC，取得病理前均未进行过抗 治疗，治疗前均已签署知情同意书，同时选取25例正常肺组织石蜡标本作为对照。 2.方法 2.1免疫组织化学 将SCLC石蜡标本以4μm的厚度进行切片，贴敷于载玻片上70℃恒温过夜，经二 脱蜡及梯度酒精脱水，组织浸泡在3%的H2O210min，消除内源过氧化物酶活性，PBS清洗后于pH6.0的枸橼酸溶液中，微波加热至沸腾20min，用1%的血清工作液滴在组织片上封闭，室温孵育30min。加入WNT5A抗体（1:200）4℃过夜，PBS清洗后后滴加HRP羊抗小鼠/兔二抗工作液，室温2h，DAB室温下显色，苏木素复染，盐酸酒精分化氨水反蓝，脱水透明后封片，显微镜下观察记录结果并保存图像。 2.2免疫组织化学半定量分析 免疫组织化学中WNT5A在SCLC中的表达，根据染色的强度以及阳性细胞百分比例计算，其中强度得分由免疫组化的染色强度评分为：0：无染色，1：浅染色，2：中等染色，3：强染色。阳性细胞比例分为：0：无阳性细胞，1：阳性细胞<10%，2：阳性细胞10%～50%，3：阳性细胞>50%。染色总分=强度得分×比例得分（0～9分）。其中总分<4分定义为低表达，总分≥4分定义为高表达。所有切片染色结果均由2名病理医师独立评分。 2.3细胞培养 应用含10%胎牛血清及1%双抗的MEM（NEAA）培养基进行DMS153培养，细胞放置于含有5%CO2的37℃培养箱中，按1:3的方式传代培养，取对数生长期的细胞用于实验操作。 2.4细胞划痕及Transwell实验 细胞划痕实验为取对数生长期的DMS153细胞接种于6孔板，待细胞达80%汇合度时划一直线，拍照并标记拍照位置，按实验要求进行处理，并于处理后24h进行照像。Transwell实验同样取对数生长的DMS153细胞，按1×105/mL的密度接种于Transwell小室上层，下层按实验设计加入含不同添加物的MEM（NEAA）培养基，其中外源rhWNT5A的添加浓度为500ng/mL，SP600125添加后的终浓度为80μM。 2.5小干扰RNA的构建 通过应用RNAi软件设计人WNT5A基因（MGC：71588IMAGE：30346200）的干扰RNA片段：Si-WNT5A：（5′-GCTGGAAGTGCAATGTCTT-3′），Si-Ctrl：（5′-GGGCTAAGCGTAATCTGTT-3′）。应用lipofectamine2000对DMS153细胞进行转染，每2×105个细胞加入5μL的siRNA进行转染，为了提高转染效率，siRNA-WNT5A在第一次转染后24h进行第2次转染。48h后通过Westernblot检测转染效率。 2.6Westernblot检测转染效率 取对数生长期的DMS153细胞接种于6孔板，待细胞汇合程度达80%按实验要求进行处理完成细胞后应用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白。按10%SDS-PAGE配制凝胶进行电泳，转膜后应用5%脱脂牛奶封闭，1抗封闭过夜（WNT5A抗体浓度为1:1000，JNK抗体浓度为1:800，p-JNK抗体浓度为1:1000）。显色液显色，暗室曝光。 结果 1.WNT5A在SCLC组织中的表达 WNT5A在SCLC组织中表达明显高于正常肺组织（图1A），其中在SCLC组织中表达评分为4.52±0.33，而正常肺组织仅为0.40±0.12。表达率为差异有统计学意义（t=11.68，P<0.001）。在SCLC组织中，WNT5A表达定位于细胞质，部分细胞间质中也可见表达，而细胞核中无表达（图1B）。 2.SCLC组织中WNT5A的表达与患者临床病理特征的关系 SCLC中WNT5A的表达在性别，年龄，吸烟指数， 生长部位， 大小等方面无统计学意义（P>0.05）。在临床分期，淋巴结转移，远处转移方面差异有统计学意义（P<0.05）。并且对淋巴结转移进行进一步分析，发现WNT5A的表达在淋巴结是否转移具有统计学意义（P<0.05），而是否为N1或N2转移则无显著差异（P>0.05）。并且NSE及Pro-GRP异常升高的病例WNT5A的表达也较高（P<0.05，表1）。 3.WNT5A对SCLC细胞DMS153迁移能力的影响 SiRNA干扰后通过Westernblot检测WNT5A的干扰效率大约下降为对照组的30%（图2A）。细胞划痕和Transwell实验结果显示干扰WNT5A可以导致DMS153迁移能力下降近50%（图2B、C）。 4.WNT5A通过磷酸化JNK促进DMS153的迁移 添加500ng/mL的外源性WNT5A（rhWNT5A）导致DMS153细胞迁移能力提升。而加入JNK抑制剂SP600125后，虽然继续给与rhWNTA仍不能增加DMS153的迁移能力（图3A，B）。并且在干扰WNT5A的表达后发现JNK的磷酸化水平明显下降，而非磷酸化JNK的表达水平无明显变化（图3C）。 讨论 SCLC高度恶性，极易早期转移，其中局限期患者约占40%，中位生存期18～23个月，广泛期约占60%，中位生存期7～12个月。大部分患者在2年内出现 转移，因此探索SCLC转移的机制，鉴定SCLC转移的预测因子以及针对性的靶向治疗对提高SCLC的治 果具有重要意义。 WNT5A作为WNT家族成员之一，在近年的 研究中成为重点。在不同 细胞中WNT5A的表达及作用相反，在结肠癌、神经母细胞瘤、导管型乳腺癌和白血病中，WNT5A处于低表达状态，下调WNT5A与 的病理分级有关，并且可以作为独立的影响预后的因素，失活的WNT5A才能有利于 进展。但另一方面高度表达的WNT5A被检测出在恶性黑色素瘤、乳腺细胞癌、胃癌和 癌中表达。WNT5A的表达与 的恶性程度相关，并且可以作为黑色素瘤患者转移和预后的独立因素。在肺癌方面，Huang等发现WNT5A在SCLC中处于高表达状态，并且高表达WNT5A与 转移相关，Lu等发现WNT5A高表达预示预后不良，Yao等发现WNT5A促进肺癌的 血管生成。本实验中，WNT5A在SCLC组织中的表达升高，并且与 的淋巴及远处转移明显相关。提示WNT5A在SCLC组织中的表达增高可能促进 的淋巴及远处转移。 NSE和Pro-GRP是近年来常规用于SCLC检测的标志物，在早期诊断、 评价、复发转移和预后的判断中有重要的作用。本实验中WNT5A与NSE及Pro-GRP的表达一致，WNT5A联合NSE或Pro-GRP可能进一步提高SCLC的检测敏感性。 细胞迁移是 发生远处转移的重要过程。WNT5A作为迁移促进因子发挥重要作用，与其他成员相比，Wnt5a缺乏转化活性，通过非经典通路来影响 的形成与发展，并且由于基因突变少见，目前有关WNT5A在 发生发展中的研究方向主要集中于该基因在转录和翻译水平上的改变。WNT5A可以通过Ror2促进伪足形成和肌动蛋白重构，并且刺激了黏附依赖性迁移和侵袭。有报道发现WNT5A作为CUTL1下游分子促进胰腺癌的侵袭和迁移，并且可以通过活化PKC激活恶性黑色素瘤的能动性。而且，WNT5A可以启动Vimentin来激活转录抑制因子Snail，导致E-cadherin下调和MMP-2产生，并且可以通过诱导EMT过程促进黑色素瘤转移。在胃癌细胞中WNT5A可以通过激活黏着斑和小GTP结合蛋白Rac的形成，促进胃癌细胞的迁移和侵袭。在前期工作中，我们发现WNT5A也可以通过JNK激活桩蛋白Paxillin通路介导胰腺癌细胞的迁移。本研究中，经SiRNA干扰后，JNK磷酸化水平下降，DMS153迁移能力下降。抑制JNK可以阻断WNT5A诱导的细胞迁移过程。说明WNT5A通过磷酸化JNK促进DMS153的迁移。 综上所述，WNT5A在SCLC组织中高表达，并且和 的淋巴及远处转移相关。WNT5A/JNK信号通路促进SCLC细胞迁移。WNT5A可能作为SCLC检测的标志物，对于WNT5A的抑制可能成为治疗SCLC的新靶点。